La siembra in vitro de orquídeas es el momento más delicado del proceso: todo lo preparado hasta ahora se pone en juego en unos minutos de trabajo aséptico. Aquí tienes los dos métodos, desde cápsula verde y desde semilla seca, con la técnica para abrir frascos sin contaminarlos.
Este artículo forma parte de la serie Cultivo in vitro de orquídeas paso a paso: corresponde a la fase 5 de 9.
Lo que vas a aprender
- Antes de sembrar: frascos liberados, zona preparada, semilla desinfectada.
- Instrumental distinto para el exterior de la cápsula y para la semilla.
Materiales necesarios
| Necesario | Alternativa disponible |
|---|---|
| Frascos de medio A liberados tras la cuarentena | — |
| Varios juegos de instrumental estéril | — |
| Jeringuillas estériles | — |
| Film transparente o Parafilm | — |
| Frasco adicional de medio para el control de ambiente | — |
Paso a paso: Siembra de cápsula verde y de semilla seca
Objeto
Sembrar en condiciones asépticas la semilla de una cápsula verde o de un lote de semilla seca sobre medio A liberado, con trazabilidad completa del lote de siembra.
Requisitos previos
| Requisito | Documento |
|---|---|
| Frascos de medio A liberados tras la cuarentena y revisados de nuevo el día de la siembra | Cómo esterilizar el medio de cultivo en olla a presión y hacer la cuarentena |
| Zona estéril preparada, operador con EPI | Seguridad y zona estéril para el cultivo in vitro |
| Material vegetal registrado y, si procede, con viabilidad conocida | Desinfección de semillas y cápsulas de orquídea y Cómo conservar semillas de orquídea y comprobar su viabilidad (prueba de tetrazolio) |
| Soluciones de desinfección preparadas el mismo día | Seguridad y zona estéril para el cultivo in vitro y Desinfección de semillas y cápsulas de orquídea |
| Código de lote de siembra asignado en VITROLAB y etiquetas impresas | tu hoja de registro |
Material
- Frascos de medio A, bisturí, pinzas y espátula estériles (varios juegos), jeringuillas estériles de 5–10 ml sin aguja, agua destilada estéril.
- Film transparente o Parafilm para sellar, etiquetas, rotulador permanente.
- Un frasco de medio adicional como control de ambiente (apartado 6).
Procedimiento A · Cápsula verde
- Introducir en la zona estéril los frascos de medio, pulverizados por fuera con etanol al 70 %. Aflojar las tapas sin abrirlas para aliviar el vacío.
- Desinfectar la cápsula según el método A de Desinfección de semillas y cápsulas de orquídea.
- Colocar la cápsula sobre una superficie estéril y cortarla longitudinalmente con el bisturí.
- Cambiar de pinzas o espátula: el instrumental que tocó el exterior de la cápsula no toca las semillas.
- Abrir cada frasco solo el tiempo imprescindible, con la abertura inclinada y sin pasar las manos por encima.
- Depositar pequeñas porciones de semilla y repartirlas en una capa fina, sin montones.
- Repartir el contenido de una cápsula entre varios frascos según su tamaño; una siembra demasiado densa compite por el medio y dificulta los repiques.
- Cerrar cada frasco al terminar y pasar al apartado 7.
- Afloja la tapa antes de empezar para aliviar el vacío.
- Ábrelo inclinado, con la boca hacia el fondo de la zona estéril.
- La tapa se sujeta boca abajo con la mano o se apoya boca abajo sobre una superficie estéril.
- Cuenta mentalmente: cuanto menos tiempo abierto, mejor.
Haz
- Repartir la semilla en capa fina.
- Cambiar de instrumental tras tocar la cápsula.
- Sellar y etiquetar antes de sacar el frasco.
Evita
- Dejar montones de semilla.
- Pasar la mano por encima de un frasco abierto.
- Sacar frascos sin etiqueta.
Procedimiento B · Semilla seca con jeringuilla
- Desinfectar y enjuagar la semilla dentro de la jeringuilla según el método B o C de Desinfección de semillas y cápsulas de orquídea.
- Aspirar una pequeña cantidad de agua estéril y agitar para dejar la semilla en suspensión.
- Abrir el frasco, depositar unas gotas sobre la superficie del medio y cerrar.
- Agitar la jeringuilla antes de cada frasco para que la semilla no se deposite.
- Inclinar suavemente el frasco cerrado para repartir la suspensión. El exceso de agua se evapora y se reabsorbe en pocos días.
Control de ambiente
Durante la sesión, un frasco de medio sin sembrar permanece abierto 10 minutos en la zona de trabajo y después se cierra y etiqueta como «control». Si en la Fase 6 aparecen colonias en ese frasco, el aire de la zona de trabajo es una fuente de contaminación.
- Qué mide
- La limpieza del aire de la zona de trabajo durante la siembra.
- Fórmula
sesiones con control de ambiente sin colonias ÷ sesiones × 100- Objetivo
- 100 %
- Si no cumple
- Revisar la preparación de la zona (Seguridad y zona estéril para el cultivo in vitro).
Cierre, sellado y etiquetado
- Apretar la tapa.
- Sellar la unión entre la tapa y el frasco con film transparente o Parafilm, con dos o tres vueltas.
- Etiquetar con el código del lote de siembra, taxón, fecha, medio (A) y método (cápsula verde o jeringuilla).
- Anotar el lote en tu hoja de registro y en VITROLAB.
- Llevar los frascos a la zona de incubación (Incubación y contaminación en frascos in vitro).
Puntos críticos
- Tiempo de frasco abierto mínimo.
- Instrumental distinto para el exterior de la cápsula y para la semilla.
- Siembra en capa fina y repartida.
- Ningún frasco sin etiqueta ni registro.
Lista de verificación
Marca cada punto mientras trabajas, no al final. Cualquier «no» merece una nota con lo que has hecho para corregirlo.
Sesión de siembra
Lo esencial
- Antes de sembrar: frascos liberados, zona preparada, semilla desinfectada.
- Un juego de instrumental para el exterior de la cápsula y otro para la semilla.
- El frasco se abre lo justo, inclinado, y nunca se pasa la mano por encima.
- Siembra en capa fina: menos semillas por frasco crecen mejor.
- El frasco de control de ambiente indica si el aire de la zona es limpio.
- Cada frasco sale de la zona sellado, etiquetado y registrado.
Del laboratorio GadesPlant: el método de la jeringuilla
Imágenes y vídeo de El método de la jeringuilla, cuyo contenido queda integrado en esta guía.
Nota: las concentraciones de desinfectante vigentes son las de la fase 1 de esta serie; si el vídeo indica otras, sigue la guía.
Preguntas frecuentes sobre la siembra in vitro de orquídeas
¿Cuántas semillas pongo en cada frasco?
Las suficientes para cubrir la superficie en una capa fina, sin montones. Una siembra demasiado densa compite por el medio y dificulta los repiques; es mejor repartir una cápsula entre varios frascos.
¿Qué es el frasco de control de ambiente?
Un frasco de medio sin sembrar que se deja abierto 10 minutos en la zona de trabajo y se cierra. Si después aparecen colonias en él, el aire de la zona era una fuente de contaminación.
¿Con qué sello los frascos tras la siembra?
Aprieta la tapa y sella la unión con film transparente o Parafilm, con dos o tres vueltas, y etiqueta cada frasco con el lote, el taxón, la fecha y el método.
Referencias
- Arditti, J. (2008). Micropropagation of Orchids, 2.ª ed. Blackwell Publishing.
- Seaton, P. y Ramsay, M. (2005). Growing Orchids from Seed. Royal Botanic Gardens, Kew.
- George, E. F., Hall, M. A. y De Klerk, G.-J. (eds.) (2008). Plant Propagation by Tissue Culture, 3.ª ed., vol. 1. Springer.
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