Cómo conservar semillas de orquídea y comprobar su viabilidad (prueba de tetrazolio)

Para conservar semillas de orquídea durante meses o años, primero hay que secarlas y después enfriarlas, nunca al revés. En esta fase aprenderás a almacenarlas como en un banco de semillas y a saber qué proporción sigue viva antes de sembrar.

Este artículo forma parte de la serie Cultivo in vitro de orquídeas paso a paso: corresponde a la fase 2 de 9.

Materiales necesarios

Necesario	Alternativa disponible
Gel de sílice con indicador de color	—
Viales de vidrio herméticos	Tubos de rosca para congelación
Higrómetro digital	—
TTC (tetrazolio) y frasco ámbar	—
Estufa a unos 30 °C	Lugar oscuro a temperatura estable
Microscopio (40–100 aumentos)	Lupa potente

Paso a paso: Secado y almacenamiento de semilla

Objeto

Secar y conservar la semilla de orquídea de forma que mantenga su viabilidad el mayor tiempo posible, con trazabilidad de cada lote.

Fundamento

• La mayoría de las semillas de orquídea toleran la desecación. Su vida en almacén aumenta cuanto más baja es su humedad y la temperatura de conservación.
• Los bancos de semillas secan la semilla en equilibrio con una humedad relativa baja (10–25 %) y la conservan en envase hermético a unos −18 °C.
• La longevidad varía mucho entre especies: algunas pierden viabilidad en pocos años incluso congeladas. Por eso se comprueba la viabilidad al almacenar y periódicamente (Cómo conservar semillas de orquídea y comprobar su viabilidad (prueba de tetrazolio)).
• La cápsula verde no se almacena: se siembra en pocos días (Desinfección de semillas y cápsulas de orquídea). Si no se va a sembrar, es preferible dejarla madurar en la planta.

Material

• Gel de sílice con indicador de color, activo (seco).
• Recipiente hermético de vidrio o plástico para el secado.
• Sobres de papel (papel de seda o de filtro) para la semilla.
• Envases finales herméticos: viales de vidrio con tapón de rosca y junta, o tubos de rosca para congelación.
• Higrómetro digital pequeño (opcional, recomendable).
• Etiquetas resistentes al frío y rotulador permanente.

Procedimiento de secado

1. Partir de semilla limpia de una cápsula madura (Desinfección de semillas y cápsulas de orquídea), registrada con su código de lote.
2. Poner la semilla en un sobre de papel etiquetado, sin llenarlo.
3. Colocar el sobre en el recipiente hermético con gel de sílice activo, sin contacto directo con la semilla. Usar bastante más gel que semilla.
4. Cerrar y dejar a temperatura ambiente, a la sombra, durante al menos 1–2 semanas.
5. Si se usa higrómetro, la humedad relativa del recipiente debe estabilizarse por debajo del 25 %.
6. Si el indicador del gel cambia de color, sustituirlo por gel activo y continuar el secado.

Envasado y conservación

1. Pasar la semilla seca a su envase final hermético dentro de un lugar seco y sin corrientes, trabajando rápido para que no recupere humedad.
2. Etiquetar con el código de lote, taxón, fecha de secado y resultado de viabilidad inicial.
3. Elegir la temperatura de conservación según el uso previsto (tabla siguiente).
4. Anotar la ubicación en tu hoja de registro y en VITROLAB.

Conservación	Temperatura	Uso
Corto plazo	Frigorífico, 4–5 °C	Semilla que se sembrará en los próximos meses.
Largo plazo	Congelador, −18 a −20 °C	Solo semilla bien seca; reserva y conservación.
Conservación avanzada	Nitrógeno líquido (criopreservación)	Laboratorios especializados; especies de vida corta en almacén.

Extracción de semilla almacenada

1. Sacar el envase del frío y dejar que alcance la temperatura ambiente cerrado, durante al menos 30–60 minutos. Así no se condensa humedad sobre la semilla.
2. Abrir, tomar la cantidad necesaria con espátula limpia y cerrar de inmediato.
3. Devolver el envase al frío y anotar la extracción en tu hoja de registro.
4. Para evitar abrir muchas veces un mismo envase, repartir cada lote en varios envases pequeños desde el principio.

Puntos críticos

• Nunca congelar semilla que no esté bien seca: el agua de la semilla forma cristales que dañan el embrión.
• Un sobre de papel por sí solo no protege de la humedad: el envase final debe ser hermético.
• No guardar semilla a temperatura ambiente sin control de humedad si se pretende conservarla.
• Repetir la prueba de viabilidad de los lotes almacenados al menos una vez al año.

Paso a paso: Prueba de viabilidad de la semilla

Objeto

Estimar qué proporción de un lote de semilla puede germinar, antes de sembrarlo o de almacenarlo, con tres pruebas complementarias.

Prueba	Qué mide	Cuándo usarla
A. Semillas con embrión	Proporción de semillas llenas frente a vacías.	Siempre, al recibir el lote. Rápida y barata.
B. Tetrazolio (TTC)	Embriones con actividad respiratoria (vivos).	Antes de almacenar y en revisiones periódicas.
C. Germinación de control	Semillas que germinan realmente en medio.	Referencia definitiva; tarda semanas o meses.

Prueba A · Semillas con embrión

1. Extender una pequeña muestra de semilla en una gota de agua sobre un portaobjetos.
2. Observar con lupa o microscopio (40–100 aumentos).
3. Contar al menos 100 semillas, separando las que tienen embrión de las vacías (transparentes).
4. Calcular: % con embrión = (semillas con embrión ÷ semillas contadas) × 100.

Prueba B · Tetrazolio (TTC)

3.1 Fundamento

El cloruro de 2,3,5-trifeniltetrazolio (TTC) es incoloro. Las enzimas respiratorias de un tejido vivo lo transforman en formazán, de color rojo. Un embrión teñido de rojo se considera vivo; uno sin teñir, no viable.

En orquídeas, la cubierta de la semilla dificulta la entrada del reactivo, por lo que hace falta un pretratamiento que la vuelva permeable.

3.2 Material y seguridad

• TTC en polvo, agua destilada, frasco ámbar, viales pequeños, estufa o lugar a temperatura estable, lupa o microscopio.
• El TTC es nocivo: guantes y gafas. Se descompone con la luz: preparar y guardar en frasco ámbar.

3.3 Procedimiento de referencia

1. Tomar tres repeticiones de semilla del lote, de al menos 100 semillas cada una.
2. Pretratamiento para permeabilizar la cubierta: inmersión breve en solución diluida de hipoclorito o remojo en agua o en solución de sacarosa durante varias horas, según el método de referencia. Enjuagar con agua destilada.
3. Cubrir la semilla con solución de TTC al 1 % en agua destilada o en tampón fosfato de pH cercano a 7.
4. Incubar en oscuridad a unos 30 °C durante 24 horas.
5. Observar con lupa o microscopio y contar, en cada repetición, los embriones teñidos de rojo y los no teñidos.
6. Anotar los resultados en tu hoja de registro.

3.4 Cálculo e interpretación

• Viabilidad (%) = (embriones teñidos ÷ semillas con embrión) × 100. Las semillas vacías no se incluyen en el cálculo; se informan aparte (prueba A).
• Se da la media de las tres repeticiones. Si difieren mucho entre sí, se repite la prueba.
• La intensidad del color no se convierte en un porcentaje: cada embrión se clasifica como teñido o no teñido. Los teñidos solo en parte se anotan aparte como dudosos.
• El TTC indica que el embrión está vivo, no que vaya a germinar: puede haber latencia o necesidades del medio no cubiertas. Además, algunas bacterias también reducen el TTC.

Prueba C · Germinación de control

1. Sembrar una muestra del lote en uno o varios frascos de medio, con el método habitual (Desinfección de semillas y cápsulas de orquídea).
2. Mantener en las condiciones de incubación de la Fase 6.
3. Contar las semillas germinadas (embrión hinchado y verde o protocormo) frente al total de semillas con embrión, en la fecha fijada para la especie.
4. Comparar con el resultado del TTC para ajustar la prueba B de esa especie.

El tiempo hasta la germinación varía mucho según la especie: de pocas semanas a varios meses. Un lote no se declara «no viable» solo porque no haya germinado en un plazo fijo.

Lista de verificación

Marca cada punto mientras trabajas, no al final. Cualquier «no» merece una nota con lo que has hecho para corregirlo.

Secado y almacenamiento

Prueba de viabilidad

Pon a prueba lo aprendido

En una repetición de la prueba de tetrazolio cuentas 120 semillas: 20 están vacías, 70 tienen el embrión teñido de rojo y 30 tienen el embrión sin teñir.

1. ¿Qué porcentaje de semillas tiene embrión? ______ %
2. ¿Cuál es la viabilidad del lote? ______ %

Solución: 1) 100 ÷ 120 × 100 = 83,3 %. 2) 70 ÷ 100 × 100 = 70 %.

Preguntas frecuentes: cómo conservar semillas de orquídea

¿Puedo congelar semillas de orquídea?

Solo si están bien secas. El agua que contiene una semilla húmeda forma cristales al congelarse y daña el embrión. Bien secas, se conservan a −18 o −20 °C.

¿Qué es la prueba de tetrazolio?

Una prueba en la que el TTC, incoloro, se vuelve rojo en los tejidos vivos. Un embrión teñido de rojo se considera vivo. En orquídeas requiere un pretratamiento para que el reactivo atraviese la cubierta.

¿Una semilla teñida germinará seguro?

No. El tetrazolio indica que el embrión está vivo, pero puede haber latencia o necesidades del medio no cubiertas. La prueba definitiva es una siembra de control.

¿Cómo saco semillas del congelador sin estropearlas?

Deja que el envase alcance la temperatura ambiente cerrado, durante 30–60 minutos, antes de abrirlo. Así no se condensa humedad sobre la semilla.

Referencias

• FAO (2014). Genebank Standards for Plant Genetic Resources for Food and Agriculture. Edición revisada. Organización de las Naciones Unidas para la Alimentación y la Agricultura, Roma.
• Pritchard, H. W. y Seaton, P. T. (1993). Orchid seed storage: historical perspective, current status, and future prospects for long-term conservation. Selbyana, 14: 89–104.
• Seaton, P. T., Hu, H., Perner, H. y Pritchard, H. W. (2010). Ex situ conservation of orchids in a warming world. The Botanical Review, 76: 193–203.
• Hay, F. R., Merritt, D. J., Soanes, J. A. y Dixon, K. W. (2010). Comparative longevity of Australian orchid (Orchidaceae) seeds under experimental and low temperature storage conditions. Botanical Journal of the Linnean Society, 164: 26–41.
• Seaton, P. y Ramsay, M. (2005). Growing Orchids from Seed. Royal Botanic Gardens, Kew.
• Van Waes, J. M. y Debergh, P. C. (1986). Adaptation of the tetrazolium method for testing the seed viability, and scanning electron microscopy study of some Western European orchids. Physiologia Plantarum, 66: 435–442.
• Arditti, J. y Ghani, A. K. A. (2000). Numerical and physical properties of orchid seeds and their biological implications. New Phytologist, 145: 367–421.
• Arditti, J. (2008). Micropropagation of Orchids, 2.ª ed. Blackwell Publishing.

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