Una buena zona estéril para el cultivo in vitro decide más resultados que cualquier fórmula de medio. En esta fase aprenderás a trabajar con seguridad con los reactivos, a preparar la glovebox o la cámara de flujo y a esterilizar frascos e instrumental.
Este artículo forma parte de la serie Cultivo in vitro de orquídeas paso a paso: corresponde a la fase 0 de 9.
Lo que vas a aprender
- El responsable prepara las soluciones concentradas; el personal técnico trabaja con diluciones.
- Lejía: se diluye leyendo los g/L de cloro activo de la etiqueta.
- Cámara de flujo solo con filtro HEPA; si no, se trabaja como glovebox.
- La zona se desinfecta con etanol 70 % de arriba abajo y del fondo hacia fuera.
Materiales necesarios
| Necesario | Alternativa disponible |
|---|---|
| Cámara de flujo laminar con filtro HEPA (H13/H14) | Glovebox o caja de aire quieto, sin llama |
| Autoclave | Olla a presión doméstica con nivel de 100 kPa |
| Mechero de alcohol (solo cámara abierta) | Varios juegos de instrumental esterilizado o esterilizador de bolas |
| Gafas de seguridad, guantes de nitrilo, bata y mascarilla | — |
| Etanol al 70 % en pulverizador | — |
| Lejía apta para la desinfección del agua de bebida | — |
| Fichas de datos de seguridad de cada producto | — |
Paso a paso: Seguridad, reactivos y gestión de residuos
Objeto y alcance
Establecer cómo se preparan, usan, almacenan y eliminan los reactivos del laboratorio, y qué protección y primeros auxilios se aplican.
Responsabilidades
- Responsable del laboratorio: prepara las soluciones concentradas y las diluciones de trabajo, custodia los reactivos y gestiona los residuos.
- Personal técnico: manipulan solo las diluciones de trabajo, siempre con el EPI indicado.
Equipo de protección individual (EPI)
| Elemento | Cuándo | Motivo |
|---|---|---|
| Gafas de seguridad | Siempre que se manipule lejía o agua oxigenada; obligatorias con agua oxigenada de 110 vol. | Riesgo de lesiones oculares graves. |
| Guantes de nitrilo | Durante toda la sesión. | Protegen la piel y reducen la contaminación del cultivo. |
| Bata | Durante toda la sesión. | Protege la ropa y reduce partículas. |
| Mascarilla | Durante la siembra. | Protege el cultivo frente a gotas al hablar o respirar. |
Reactivos autorizados en el laboratorio
| Reactivo | Uso | Peligro y precauciones |
|---|---|---|
| Etanol 70 % (v/v) | Superficies, guantes, frascos e instrumental. | Inflamable. Nunca cerca de una llama encendida. Es la concentración más eficaz como desinfectante; no elimina esporas. |
| Etanol 96 % | Solo para flameado de instrumental en cámara de flujo abierta. | Muy inflamable. Prohibido dentro de una glovebox cerrada con llama. |
| Lejía (hipoclorito sódico) | Desinfección de cápsulas y semillas, superficies. | Corrosiva. Nunca mezclar con ácidos (libera cloro gas), con amoníaco (cloraminas) ni con agua oxigenada. |
| Agua oxigenada 3 % (10 vol) | Desinfección suave de semillas y explantos. | Irritante para ojos y piel. |
| Agua oxigenada 30 % (110 vol) | Solo para preparar diluciones; la manipula solo el responsable del laboratorio. | Oxidante fuerte y corrosiva: quemaduras y lesiones oculares graves. Envase original, en frío y oscuridad. |
| Tween 20 o lavavajillas neutro | Tensioactivo para mojar bien semillas y cápsulas. | Bajo riesgo. |
| Agua destilada estéril | Diluciones y enjuagues. | Esterilizada en olla (Seguridad y zona estéril para el cultivo in vitro). |
Excluido del laboratorio: el cloruro de mercurio, que aparece en protocolos antiguos, es muy tóxico para las personas y el medio ambiente y está sometido a fuertes restricciones legales.
Preparación de diluciones
Todas las diluciones se calculan con la fórmula C₁ × V₁ = C₂ × V₂: concentración inicial por volumen inicial igual a concentración final por volumen final.
🧮 Hazlo sin errores con nuestra calculadora de diluciones (lejía, agua oxigenada y etanol).
5.1 Lejía: leer siempre la etiqueta
La concentración de la lejía comercial se indica en la etiqueta como gramos de cloro activo por litro, y suele estar entre 35 y 50 g/L. Una dilución expresada en «%» se refiere al cloro activo de la solución final, no al porcentaje de lejía.
- Usar lejía «apta para la desinfección del agua de bebida», sin perfumes ni detergentes añadidos.
- Usar una botella reciente: el hipoclorito pierde riqueza con el tiempo, la luz y el calor.
- Preparar la dilución el mismo día de uso y desechar el sobrante.
| Lejía (etiqueta) | Objetivo | Lejía | Agua estéril |
|---|---|---|---|
| 40 g/L | 1 % (10 g/L) | 25 ml | 75 ml |
| 40 g/L | 0,5 % (5 g/L) | 12,5 ml | 87,5 ml |
| 50 g/L | 1 % (10 g/L) | 20 ml | 80 ml |
| 50 g/L | 0,5 % (5 g/L) | 10 ml | 90 ml |
5.2 Agua oxigenada
Los «volúmenes» indican los litros de oxígeno que libera un litro de solución. Equivalencias aproximadas: 10 vol ≈ 3 %; 30 vol ≈ 9 %; 110 vol ≈ 30 %.
- Para obtener 100 ml al 3 % desde 110 vol: 10 ml de agua oxigenada en 90 ml de agua estéril.
- Añadir siempre el agua oxigenada sobre el agua, nunca al revés.
- Guardar en envase opaco y cerrado; se descompone con la luz y el calor.
Etiqueta: 40 g/L de cloro activo. Necesitas 200 ml al 1 % (10 g/L). 40 × V₁ = 10 × 200 → V₁ = 50 ml de lejía + 150 ml de agua estéril.
Escribe en cada dilución la concentración y la hora de preparación. Al final de la sesión, todo lo que no lleve la fecha del día se desecha.
Llama, UV y olla a presión
- Llama: el mechero de alcohol solo se usa en cámara de flujo abierta y lejos de recipientes con etanol. Nunca dentro de una glovebox cerrada: los vapores de etanol se acumulan y pueden inflamarse.
- Alternativa a la llama: varios juegos de instrumental esterilizado en olla, envueltos en papel de aluminio, que se van cambiando durante la sesión; o un esterilizador de bolas de vidrio.
- Lámpara UV-C: nunca exponer la piel ni los ojos; encenderla solo con la cabina cerrada y apagarla antes de abrir.
- Olla a presión: no abrir con presión; dejar enfriar hasta que baje la válvula; no superar el nivel máximo de llenado; revisar juntas y válvulas antes de cada uso.
Los vapores del etanol se acumulan en un recinto cerrado y pueden inflamarse con la llama. En la glovebox se trabaja con varios juegos de instrumental esterilizados en olla.
Gestión de residuos
| Residuo | Procedimiento |
|---|---|
| Diluciones de lejía usadas | Verter al desagüe con abundante agua, por separado de otros productos y salvo que la normativa municipal indique otra cosa. |
| Agua oxigenada 3 % usada | Verter al desagüe con abundante agua. |
| Restos de agua oxigenada 30 % | Diluir antes al menos 1:10 en agua; después, como la anterior. |
| Etanol | Pequeñas cantidades: dejar evaporar en lugar ventilado y sin llamas. |
| Frascos contaminados | No abrirlos. Esterilizarlos cerrados en la olla (al menos 30 minutos a presión) y, una vez fríos, vaciar y lavar. Así se evita liberar esporas. |
| Material desechable | Bolsa cerrada al contenedor de resto. |
Primeros auxilios
- Ojos: lavar con agua abundante durante al menos 15 minutos con los párpados abiertos y acudir a urgencias.
- Piel: retirar la ropa contaminada y lavar con agua abundante.
- Ingestión: no provocar el vómito. Llamar al Servicio de Información Toxicológica (91 562 04 20) o al 112.
- Tener en el laboratorio la ficha de datos de seguridad (FDS) de cada producto.
Paso a paso: Zona estéril y esterilización del material
Objeto
Preparar la zona de trabajo estéril y esterilizar frascos, instrumental y agua antes de cualquier manipulación de cultivo.
Tipos de zona de trabajo
| Equipo | Funcionamiento | Observaciones |
|---|---|---|
| Cámara de flujo laminar | Impulsa aire a través de un filtro HEPA hacia la zona de trabajo y arrastra las partículas hacia fuera. | Encender 15–30 minutos antes de usarla. Trabajar dentro, a unos 15 cm del borde. |
| Glovebox o caja de aire quieto | Recinto cerrado sin corriente de aire; reduce las partículas en suspensión. | Sin llama en su interior. Movimientos lentos. |
| Cámara casera con ventilador | Depende del filtro. | Solo se considera de flujo laminar si el aire pasa por un filtro HEPA certificado (H13 o H14). Sin ese filtro, se trata como glovebox. |
Preparación de la zona
- Retirar de la zona todo lo que no se vaya a usar.
- Si hay suciedad visible, limpiar con agua y jabón y secar.
- Desinfectar con etanol 70 % de arriba abajo y del fondo hacia la abertura. Dejar evaporar.
- Opcional: lámpara UV-C 15–30 minutos con la cabina cerrada y sin nadie mirando (Seguridad y zona estéril para el cultivo in vitro).
- Pulverizar con etanol 70 % el exterior de cada frasco y objeto antes de introducirlo.
- Colocar el material separando la zona limpia (frascos estériles) de la zona sucia (restos y residuos).
- No hablar, toser ni estornudar hacia la zona. Mover las manos despacio.
- Zona limpia al fondo, zona de trabajo en el centro y residuos junto a la abertura.
- Las manos nunca pasan por encima de un frasco abierto.
- Cada objeto entra una sola vez, pulverizado con etanol 70 %, y no vuelve a salir hasta terminar.
Haz
- Encender la cámara de flujo 15–30 minutos antes.
- Mover las manos despacio.
- Cambiar de guantes si tocas algo no estéril.
Evita
- Hablar o toser hacia la zona.
- Usar llama dentro de la glovebox.
- Sacar y volver a meter objetos durante la sesión.
Higiene del operador
- Lavado de manos con jabón durante 20–30 segundos, incluidas uñas y muñecas.
- Guantes de nitrilo desinfectados con etanol 70 % y renovados si se tocan superficies no estériles.
- Bata limpia, pelo recogido y mascarilla.
Esterilización por vapor (olla a presión o autoclave)
La esterilización por vapor saturado a 121 °C se alcanza a unos 15 psi (≈ 1 bar) de presión manométrica. El tiempo se cuenta desde que se alcanza la presión de trabajo.
- Muchas ollas domésticas trabajan por debajo de 15 psi y, por tanto, por debajo de 121 °C. Hay que comprobar la presión máxima en los datos del fabricante. Si es menor, se prolonga el tiempo y se valida el resultado. Nunca se modifican las válvulas.
- El tiempo necesario aumenta con el volumen de cada recipiente: los tiempos para medios de cultivo se fijan en el PNT de la Fase 4.
- La cinta indicadora solo demuestra que la carga se expuso al calor; no demuestra la esterilidad. La validación se hace con indicadores biológicos (esporas de Geobacillus stearothermophilus).
- Las tapas se dejan ligeramente flojas durante la esterilización y se cierran al sacar los frascos.
Material y método de esterilización
| Material | Método | Notas |
|---|---|---|
| Frascos de vidrio y tapas de PP (código 5) | Vapor a 121 °C. | El PP resiste el vapor; PS (6), PET (1) y PE de baja densidad (4) no. |
| Instrumental metálico | Vapor, envuelto en papel de aluminio; o calor seco en horno a 170 °C durante 60 minutos o a 160 °C durante 120 minutos. | Preparar varios juegos para cambiarlos durante la sesión. |
| Jeringuillas | Usar jeringuillas nuevas, estériles de fábrica. | No reutilizar ni reesterilizar las de plástico desechable. |
| Agua destilada | Vapor, en frascos de vidrio con tapa floja. | Para diluciones y enjuagues. |
| Papel, gasas y pañuelos | Vapor, en sobres de papel de aluminio. | Abrir solo dentro de la zona estéril. |
Puntos críticos
- Presión y tiempo de la olla registrados en tu hoja de registro.
- Ningún frasco se abre fuera de la zona estéril.
- El instrumental que toca una superficie no estéril se sustituye.
Lista de verificación
Marca cada punto mientras trabajas, no al final. Cualquier «no» merece una nota con lo que has hecho para corregirlo.
Preparación de la sesión
Lo esencial
- La semilla de orquídea no tiene reservas: en el laboratorio el alimento lo pone el medio de cultivo (azúcar y sales). Por eso funciona sin hongo: germinación asimbiótica.
- Ese mismo medio es un festín para hongos y bacterias. La asepsia decide el éxito.
- Cápsula verde: el interior suele ser estéril; se desinfecta el exterior y se siembra en pocos días.
- Semilla seca: se puede guardar, pero hay que desinfectarla antes de sembrar.
- Desinfectar no es esterilizar: el alcohol no elimina esporas; el vapor a 121 °C sí.
Diez reglas de oro
- Gafas y guantes siempre que haya lejía o agua oxigenada.
- Nunca mezclar lejía con ácidos, amoníaco ni agua oxigenada.
- Leer la etiqueta de la lejía y calcular la dilución, no hacerla «a ojo».
- Preparar las diluciones el mismo día.
- Ninguna llama dentro de una glovebox cerrada.
- Ningún frasco se abre fuera de la zona estéril.
- Movimientos lentos y sin hablar hacia la zona de trabajo.
- Controlar los tiempos de desinfección con temporizador.
- Todo material lleva código y registro.
- Los frascos contaminados no se abren: se esterilizan cerrados.
Pon a prueba lo aprendido
La etiqueta de la lejía indica 40 g/L de cloro activo. Necesitas 200 ml de solución al 1 % (10 g/L). ¿Cuánta lejía y cuánta agua estéril usas?
Fórmula: C₁ × V₁ = C₂ × V₂ → 40 × V₁ = 10 × 200 → V₁ = ______ ml de lejía + ______ ml de agua.
Del laboratorio GadesPlant: esterilización del material
Imágenes de Sobre limpieza y esterilización de útiles e instrumental, cuyo contenido queda integrado en esta guía.
Preguntas frecuentes sobre la zona estéril en el cultivo in vitro
¿Puedo trabajar sin cámara de flujo laminar?
Sí, con una glovebox o caja de aire quieto, trabajando con movimientos lentos y sin llama. Una cámara casera solo se considera de flujo laminar si el aire pasa por un filtro HEPA certificado (H13 o H14).
¿Qué alcohol uso para desinfectar?
Etanol al 70 %: es la concentración más eficaz como desinfectante. No elimina esporas, por eso no sustituye a la esterilización por vapor.
¿Puedo usar un mechero dentro de la glovebox?
No. Los vapores de etanol se acumulan en el recinto cerrado y pueden inflamarse. Usa varios juegos de instrumental esterilizado en olla o un esterilizador de bolas.
¿Cómo calculo la dilución de lejía?
Lee los gramos de cloro activo por litro de la etiqueta y aplica C₁ × V₁ = C₂ × V₂. Con lejía de 40 g/L, para 100 ml al 1 % necesitas 25 ml de lejía y 75 ml de agua estéril.
Referencias
- Rutala, W. A., Weber, D. J. y HICPAC (2008, actualizada). Guideline for Disinfection and Sterilization in Healthcare Facilities. Centers for Disease Control and Prevention (CDC).
- George, E. F., Hall, M. A. y De Klerk, G.-J. (eds.) (2008). Plant Propagation by Tissue Culture, 3.ª ed., vol. 1. Springer.
- Seaton, P. y Ramsay, M. (2005). Growing Orchids from Seed. Royal Botanic Gardens, Kew.
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