El repique de plántulas de orquídea in vitro les da medio nuevo y espacio para seguir creciendo dentro del frasco hasta alcanzar el tamaño de rustificación. Es también una apertura de frascos, así que se trabaja con la misma técnica aséptica que la siembra.
Este artículo forma parte de la serie Cultivo in vitro de orquídeas paso a paso: corresponde a la fase 7 de 9.
Lo que vas a aprender
- Cuándo: el frasco está lleno, el medio se agota u oscurece, o las plántulas tienen hojas y empiezan a enraizar.
- Dónde: siempre en la zona estéril, con frascos de medio B liberados.
Materiales necesarios
| Necesario | Alternativa disponible |
|---|---|
| Pinzas largas (20–25 cm) estériles | — |
| Espátula o cucharilla estéril | — |
| Papel de aluminio esterilizado como superficie de trabajo | Placa de Petri estéril |
| Frascos de medio B liberados | — |
| Agua destilada estéril | — |
Paso a paso: Repique de protocormos y plántulas
Subcultivo a medio B (P668 + plátano + agua de coco)
Por qué importa
Las plántulas consumen los nutrientes y el azúcar del medio y, al crecer, compiten por el espacio. Repicar es darles medio nuevo y sitio para seguir creciendo dentro del frasco hasta que tengan el tamaño necesario para la rustificación. Cada repique es también una apertura de frascos: un riesgo de contaminación que se controla con la misma técnica que la siembra.
Cuándo repicar
| Señal | Qué indica |
|---|---|
| Superficie del medio cubierta de protocormos o plántulas | Falta de espacio: las plántulas compiten entre sí. |
| Medio oscurecido, encogido o separado del vidrio | Medio agotado o deshidratado. |
| Plántulas con hojas y primeras raíces | Momento habitual del primer repique en muchas epífitas. |
| Hojas que tocan la tapa | Falta de altura: repicar a un frasco mayor o preparar la rustificación. |
| Contaminación en un frasco valioso | Repique de rescate (Incubación y contaminación en frascos in vitro). |
Material y equipo
| Equipo | Consumibles |
|---|---|
| ☐ Zona estéril preparada (Seguridad y zona estéril para el cultivo in vitro) | ☐ Frascos de medio B liberados (Cómo esterilizar el medio de cultivo en olla a presión y hacer la cuarentena) |
| ☐ Pinzas largas (20–25 cm), estériles, varios juegos | ☐ Agua destilada estéril |
| ☐ Espátula o cucharilla estéril | ☐ Hojas de papel de aluminio esterilizadas, como superficie de trabajo |
| ☐ Bisturí estéril | ☐ Film o Parafilm, etiquetas |
Procedimiento
- Revisa a contraluz el frasco de origen y los frascos de medio B. Si el de origen tiene contaminación, aplica Incubación y contaminación en frascos in vitro.
- Introduce todo en la zona estéril, pulverizado con etanol al 70 %. Afloja las tapas.
- Abre el frasco de origen y extrae un grupo de plántulas con pinzas o espátula, sin arrancar raíces.
- Colócalo sobre la hoja de aluminio estéril y separa las plántulas con suavidad. Retira el medio viejo pegado y el tejido marrón o muerto.
- Clasifica por tamaño: las plántulas parecidas crecen mejor juntas.
- Planta en el medio B en filas, introduciendo la base y las raíces en el agar y dejando las hojas fuera. Deja espacio entre plántulas.
- Cierra, sella y etiqueta con el código del lote de repique, que enlaza con el lote de siembra de origen.
- Anota el repique en tu hoja de registro y en VITROLAB. Lleva los frascos a incubación (Incubación y contaminación en frascos in vitro).
- Sujeta el grupo por el medio viejo, no por las hojas.
- Separa tirando en sentido horizontal y despacio: las raíces de orquídea se rompen con facilidad.
- Si un grupo no se separa sin romper raíces, plántalo entero: se separará en el siguiente repique.
Cuando el frasco de origen está lleno de protocormos pequeños, añade un poco de agua destilada estéril, cierra y agita con suavidad: los protocormos se sueltan del medio y se pueden verter o recoger con la espátula sin tocarlos uno a uno.
Las hojas enterradas en el agar se pudren. Solo la base de la plántula y las raíces van dentro del medio.
Haz
- Trabajar un frasco de origen cada vez.
- Cambiar de instrumental entre frascos de origen.
- Retirar el tejido marrón antes de plantar.
- Mantener el código del lote de siembra en el repique.
Evita
- Mezclar plántulas de dos frascos de origen distintos.
- Repicar un frasco contaminado junto a los sanos.
- Plantar tan juntas que las hojas se toquen.
- Dejar el frasco abierto mientras separas plántulas.
Si algo sale mal
| Síntoma | Causa probable | Qué hacer |
|---|---|---|
| Plántulas amarillas tras el repique | Estrés del trasplante o raíces dañadas | Esperar dos semanas; revisar la técnica de separación |
| Contaminación en los primeros días | Instrumental, frasco de origen o apertura prolongada | Analizar el origen (Incubación y contaminación en frascos in vitro) |
| Plántulas que no arraigan en el medio | Plantadas en superficie o medio demasiado duro | Introducir la base en el agar; revisar el agar del medio B |
| Hojas que se pudren | Hojas enterradas o exceso de humedad | Plantar solo con la base dentro del medio |
Indicadores de calidad
- Qué mide
- La asepsia del repique.
- Fórmula
frascos contaminados a los 14 días ÷ frascos repicados × 100- Objetivo
- Interno provisional: fijarlo con los diez primeros repiques
- Si no cumple
- Analizar el origen (Incubación y contaminación en frascos in vitro).
Repique R-2026-009: un frasco de origen repartido en 5 frascos nuevos; a los 14 días, 0 contaminados → 0 %. Se registra también el número de plántulas por frasco para el siguiente repique.
Lista de verificación
Marca cada punto mientras trabajas, no al final. Cualquier «no» merece una nota con lo que has hecho para corregirlo.
Sesión de repique
Lo esencial
- El repique da medio nuevo y espacio: se decide mirando el frasco, no el calendario.
- Un frasco de origen cada vez, con instrumental propio.
- Separar despacio: las raíces de orquídea se rompen con facilidad.
- Base y raíces dentro del agar; hojas fuera.
- El lote de repique conserva el código de la siembra de origen.
Pon a prueba lo aprendido
Tienes dos frascos de origen del mismo cruce, uno limpio y otro con una pequeña colonia de hongo en un borde. ¿Cómo organizas el repique?
Preguntas frecuentes sobre el repique de plántulas de orquídea in vitro
¿Cuándo hay que repicar?
Cuando la superficie del medio está cubierta, el medio se oscurece o se agota, o las plántulas tienen hojas y primeras raíces. No hay una fecha fija: se decide mirando el frasco.
¿Qué medio uso para repicar?
Un medio de mantenimiento. En esta guía usamos P668 a dosis completa con 50 g/L de plátano y 50 ml/L de agua de coco, a pH 5,7.
¿Qué hago si las raíces no se separan?
Planta el grupo entero sin forzarlo: se separará en el siguiente repique. Las raíces de orquídea se rompen con facilidad.
Referencias
- Arditti, J. (2008). Micropropagation of Orchids, 2.ª ed. Blackwell Publishing.
- George, E. F., Hall, M. A. y De Klerk, G.-J. (eds.) (2008). Plant Propagation by Tissue Culture, 3.ª ed., vol. 1. Springer.
- Seaton, P. y Ramsay, M. (2005). Growing Orchids from Seed. Royal Botanic Gardens, Kew.
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