La contaminación en frascos in vitro es la causa más frecuente de pérdidas, pero casi siempre tiene un origen identificable. En esta fase verás qué condiciones de luz y temperatura necesitan los frascos, cómo distinguir bacterias de hongos sin abrirlos y cómo actuar sin dispersar el problema.
Este artículo forma parte de la serie Cultivo in vitro de orquídeas paso a paso: corresponde a la fase 6 de 9.
Lo que vas a aprender
- 22–26 °C estables, 12–16 horas de luz suave; nunca sol directo.
- Los grados Kelvin indican el color de la luz, no su intensidad.
- Bacterias: brillo y viscosidad; hongos: algodón que crece en círculo.
- Un frasco contaminado nunca se abre fuera de la zona estéril.
Materiales necesarios
| Necesario | Alternativa disponible |
|---|---|
| Estantería con iluminación LED y temporizador | — |
| Termómetro de máxima y mínima | — |
| Luxómetro | Aplicación de medición del móvil (orientativa) |
| Zona de cuarentena separada | — |
Paso a paso: Incubación y seguimiento de los frascos sembrados
Objeto
Mantener los frascos sembrados en condiciones estables de temperatura y luz y revisarlos de forma periódica y registrada hasta el primer repique.
Condiciones de incubación
| Parámetro | Valor de trabajo | Observaciones |
|---|---|---|
| Temperatura | 22–26 °C, estable | Las salas de cultivo suelen trabajar a unos 25 °C. Las oscilaciones bruscas producen condensación en el frasco. |
| Fotoperiodo | 12–16 horas de luz al día | Temporizador obligatorio. |
| Intensidad de luz | Baja a moderada: unos 20–40 µmol·m⁻²·s⁻¹ | Equivale aproximadamente a 1.500–3.000 lux con LED blanco. La temperatura de color (por ejemplo, 6500 K) no indica intensidad. |
| Primeras semanas | Luz baja o penumbra | Muchas epífitas germinan con luz o sin ella; algunas especies, sobre todo terrestres, germinan mejor en oscuridad. |
| Luz solar directa | Nunca | Calienta el frasco y quema los protocormos. |
Un termómetro de máxima y mínima en la balda de incubación muestra las oscilaciones de la noche, que no se ven al revisar de día.
Si un luxómetro marca 2.000 lux en la balda con LED blanco, la intensidad es aproximadamente 25–35 µmol·m⁻²·s⁻¹: dentro del intervalo de trabajo. La conversión es orientativa y depende del tipo de LED.
Ubicación
- Estantería limpia, lejos de radiadores, ventanas y corrientes de aire.
- Frascos separados por lotes, con las etiquetas visibles.
- Zona de cuarentena aparte para frascos dudosos.
- Limpieza semanal de las baldas con etanol al 70 %.
Revisión periódica
- Revisar todos los frascos sin abrirlos: dos veces por semana durante el primer mes y después una vez por semana.
- Buscar signos de contaminación (Incubación y contaminación en frascos in vitro) y de germinación: embrión hinchado, color verde, protocormos.
- Fotografiar uno o dos frascos representativos de cada lote para documentar la evolución.
- Anotar cada revisión en tu hoja de registro y en VITROLAB.
- Revisar también el frasco de control de ambiente de cada sesión de siembra.
- Qué mide
- El resultado global de desinfección, siembra y ambiente.
- Fórmula
frascos contaminados a los 14 días ÷ frascos sembrados × 100- Objetivo
- Interno provisional: fijarlo con los diez primeros lotes
- Si no cumple
- Analizar el origen con Incubación y contaminación en frascos in vitro.
Tiempos orientativos
El tiempo hasta la germinación y la formación de protocormos varía mucho según el género y la especie: de pocas semanas a varios meses. Un lote no se descarta por no haber germinado en un plazo fijo.
El primer repique (Fase 7) se hace cuando los protocormos o plántulas ocupan la superficie del medio, el medio empieza a agotarse u oscurecerse, o aparecen las primeras hojas y raíces.
Paso a paso: Identificación y gestión de contaminaciones
Objeto
Reconocer a tiempo las contaminaciones, actuar sin dispersarlas y averiguar su origen para corregir el proceso.
Identificación visual
| Tipo | Aspecto | Aparición habitual | Origen más probable |
|---|---|---|---|
| Bacterias | Zonas húmedas, brillantes o viscosas; colonias blancas, amarillas, rosadas o transparentes; turbidez alrededor de la semilla. | Primeros días | Desinfección insuficiente de la semilla, agua no estéril, manipulación. |
| Hongos filamentosos | Micelio algodonoso blanco, gris, verde o negro que crece en círculo. | Días a semanas | Esporas del aire, sellado deficiente, instrumental. |
| Levaduras | Colonias pequeñas, cremosas y de borde definido. | Días | Aire, manipulación. |
| Bacterias latentes | Halo turbio que aparece semanas después, a menudo tras un repique. | Semanas o meses | Bacterias que viven dentro de los tejidos y no se eliminan con la desinfección superficial. |
Los virus no son una contaminación del medio: no pueden multiplicarse sin células vivas. Los principales virus de las orquídeas (como el CymMV y el ORSV) se consideran no transmisibles por semilla, por lo que la siembra produce plántulas libres de ellos.
Actuación ante un frasco contaminado
- No abrir el frasco fuera de la zona estéril.
- Separarlo de inmediato a la zona de cuarentena y anotarlo en tu hoja de registro.
- Si el contenido no es valioso o la contaminación es extensa: esterilizarlo cerrado en la olla y desecharlo (Seguridad y zona estéril para el cultivo in vitro).
- Si es valioso y hay protocormos o plántulas sin contacto visible con la contaminación: rescate en la zona estéril, trasladando con instrumental estéril solo el material más alejado del foco a medio nuevo. Cambiar de instrumental después de cada pase. Etiquetar como «rescate».
- Revisar el lote completo: si varios frascos se contaminan a la vez, el origen suele ser común (medio, desinfección, sesión de siembra).
- Trabaja con el frasco contaminado al final de la sesión, nunca al principio.
- Toma solo protocormos o plántulas del lado opuesto al foco.
- Un instrumento para cada pase y medio nuevo para cada grupo rescatado.
- Etiqueta «rescate» y vigílalo como un lote aparte.
Al abrirlo se liberan miles de esporas que contaminan la zona y los frascos cercanos. La identificación se hace a través del vidrio.
Análisis del origen
| Patrón observado | Origen probable y acción |
|---|---|
| Contaminación en el frasco de control de ambiente | Aire de la zona de trabajo: revisar limpieza, corrientes y preparación de la cabina. |
| Todos los frascos de un mismo lote de medio, incluso sin sembrar | Esterilización del medio: revisar el ciclo y validar con indicadores (Cómo esterilizar el medio de cultivo en olla a presión y hacer la cuarentena). |
| Contaminación que nace en las semillas, en varios frascos de un lote de siembra | Desinfección de la semilla: revisar concentración, tiempo y soluciones (Desinfección de semillas y cápsulas de orquídea). |
| Hongos que entran por el borde de la tapa semanas después | Sellado deficiente o ácaros: revisar sellado y limpieza de baldas. |
Lote de siembra S-2026-031: 4 de 12 frascos contaminados por bacterias que nacen en las semillas, control de ambiente limpio y lote de medio sin incidencias. Origen probable: desinfección de la semilla. Acción: revisar concentración y tiempo en tu hoja de registro.
Prevención de la contaminación cruzada
- Los ácaros y pequeños insectos pueden transportar esporas entre frascos: mantener la zona de incubación limpia y alejada de plantas de cultivo y sustratos.
- No guardar frascos contaminados junto a los sanos.
- Antisépticos caseros (canela, vitaminas) no sustituyen a la asepsia ni rescatan un frasco contaminado: no forman parte de este procedimiento.
Lista de verificación
Marca cada punto mientras trabajas, no al final. Cualquier «no» merece una nota con lo que has hecho para corregirlo.
Zona de incubación (semanal)
Lo esencial
- Temperatura estable (22–26 °C), fotoperiodo con temporizador y luz suave; nunca sol directo.
- Los «K» de una bombilla indican el color de la luz, no su intensidad.
- Revisar sin abrir: dos veces por semana el primer mes.
- Bacterias: brillo y viscosidad en pocos días. Hongos: algodón que crece en círculo.
- Un frasco contaminado no se abre fuera de la zona estéril.
- Si varios frascos se contaminan a la vez, busca la causa común.
- La paciencia es parte del método: algunas especies tardan meses en germinar.
Pon a prueba lo aprendido
El frasco de control de ambiente de una sesión aparece con dos colonias de hongo y los frascos sembrados ese día también. ¿Cuál es el origen más probable?
Del laboratorio GadesPlant: rescate de un frasco contaminado
Caso real documentado en Solución efectiva para la contaminación en frascos, cuyo contenido queda integrado en esta guía: apertura de urgencia de un frasco contaminado y rescate de las plántulas sanas.
Nota: el vídeo es anterior a la revisión técnica de 2026; si aparece algún paso distinto a esta guía, sigue la guía.
Preguntas frecuentes sobre la contaminación en frascos in vitro
¿Qué luz y temperatura necesitan los frascos?
Entre 22 y 26 °C estables, 12–16 horas de luz al día y una intensidad baja a moderada, de unos 20–40 µmol·m⁻²·s⁻¹. Nunca sol directo. Los grados Kelvin de una bombilla indican su color, no su intensidad.
¿Cómo distingo bacterias de hongos?
Las bacterias forman zonas brillantes o viscosas y turbidez en los primeros días. Los hongos forman micelio algodonoso que crece en círculo, de días a semanas después.
¿Puedo salvar un frasco contaminado?
Si el contenido es valioso y hay plántulas lejos del foco, se pueden rescatar en la zona estéril pasando solo ese material a medio nuevo. Si no, el frasco se esteriliza cerrado y se desecha.
¿Cuánto tardan en germinar las semillas?
Varía mucho según la especie: de pocas semanas a varios meses. Un lote no se descarta por no haber germinado en un plazo fijo.
Referencias
- George, E. F., Hall, M. A. y De Klerk, G.-J. (eds.) (2008). Plant Propagation by Tissue Culture, 3.ª ed., vol. 1. Springer.
- Arditti, J. (2008). Micropropagation of Orchids, 2.ª ed. Blackwell Publishing.
- Seaton, P. y Ramsay, M. (2005). Growing Orchids from Seed. Royal Botanic Gardens, Kew.
- Rasmussen, H. N. (1995). Terrestrial Orchids: From Seed to Mycotrophic Plant. Cambridge University Press.
- Leifert, C., Morris, C. E. y Waites, W. M. (1994). Ecology of microbial saprophytes and pathogens in tissue culture and field-grown plants: reasons for contamination problems in vitro. Critical Reviews in Plant Sciences, 13: 139–183.
- Zettler, F. W., Ko, N. J., Wisler, G. C., Elliott, M. S. y Wong, S. M. (1990). Viruses of orchids and their control. Plant Disease, 74: 621–626.
- Rutala, W. A., Weber, D. J. y HICPAC (2008, actualizada). Guideline for Disinfection and Sterilization in Healthcare Facilities. Centers for Disease Control and Prevention (CDC).
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