Para esterilizar el medio de cultivo en olla a presión no basta con «llegar a presión»: importan el nivel de la olla, el aire que queda dentro y el volumen de cada frasco. En esta fase verás tiempos concretos, cómo validar el ciclo y por qué el medio pasa una semana en cuarentena antes de usarse.
Este artículo forma parte de la serie Cultivo in vitro de orquídeas paso a paso: corresponde a la fase 4 de 9.
Lo que vas a aprender
- Siempre nivel II (100 kPa, ≈ 120 °C).
- El tiempo se cuenta desde la salida continua de vapor.
- Al menos 7 días a 20–25 °C antes de usar el medio.
- Revisión a los días 3 y 7, sin abrir.
Materiales necesarios
| Necesario | Alternativa disponible |
|---|---|
| Olla a presión con nivel de 100 kPa y rejilla | Autoclave |
| Cinta indicadora de esterilización | — |
| Indicador químico integrador (clase 5) | — |
| Indicador biológico (Geobacillus stearothermophilus) | — |
| Guantes térmicos | — |
| Linterna para revisar a contraluz | — |
Paso a paso: Esterilización del medio en olla a presión Monix Tempo (M541002, 6 L)
Objeto
Esterilizar los frascos con medio A o B en la olla a presión del laboratorio, con tiempos ajustados a su presión real y al volumen de medio por frasco.
Datos del equipo
| Dato | Valor | Fuente |
|---|---|---|
| Modelo | Monix Tempo M541002, 6 L | Etiqueta del equipo |
| Presión de funcionamiento, nivel I | 60 kPa (≈ 113 °C) | Manual del fabricante (sección en español) |
| Presión de funcionamiento, nivel II | 100 kPa (≈ 120 °C) | Manual del fabricante (sección en español) |
| Llenado máximo | 2/3 de la capacidad | Manual del fabricante |
| Líquido mínimo para alcanzar presión | 1/4 de litro | Manual del fabricante |
La sección en inglés del mismo manual indica otras cifras (100 y 160 kPa). Se toman las de la sección en español, que coinciden con las de otros modelos de la marca. La validación con indicadores (apartado 6) confirma en la práctica que el ciclo es eficaz.
Las temperaturas se obtienen de las tablas de vapor saturado a nivel del mar: 100 kPa de presión manométrica equivalen a unos 120 °C, prácticamente las condiciones de un autoclave (121 °C). Con 60 kPa solo se alcanzan unos 113 °C, insuficientes con los tiempos de referencia. Se usa siempre el nivel II.
Tiempos de esterilización
El tiempo necesario aumenta con el volumen de líquido de cada recipiente, porque el centro del medio tarda en alcanzar la temperatura. Los tiempos de referencia a 121 °C proceden de Burger (1988). Para la olla (≈ 120 °C) se aplica un factor de 1,25, que compensa 1 °C menos de temperatura, y se redondea al alza a múltiplos de 5 minutos.
| Volumen por recipiente | Referencia a 121 °C | Olla Tempo, nivel II |
|---|---|---|
| Hasta 25 ml | 20 min | 25 min |
| 50 ml | 25 min | 35 min |
| 100 ml | 28 min | 35 min |
| 250 ml | 31 min | 40 min |
| 500 ml | 35 min | 45 min |
- Medio A (25–30 ml por frasco): 35 minutos, porque se aplica el tiempo del tramo superior (50 ml).
- Medio B (30–50 ml por frasco): 35 minutos.
- Agua destilada en frascos de hasta 100 ml: 35 minutos.
- Si en una misma carga hay volúmenes distintos, manda el recipiente de mayor volumen.
- No alargar más de lo necesario: el exceso de calor oscurece el medio, degrada parte de la sacarosa y baja el pH.
Procedimiento
- Revisar la junta, la válvula de funcionamiento y la válvula de seguridad, según el manual.
- Colocar una rejilla o soporte en el fondo para que los frascos no toquen la base.
- Añadir agua corriente hasta cubrir la rejilla, con un mínimo de 1/4 de litro según el manual, y suficiente para todo el ciclo sin que se seque. El agua no debe alcanzar las tapas.
- Colocar los frascos con las tapas sin apretar y cubiertos con papel de aluminio, sin superar los 2/3 de la capacidad de la olla.
- Cerrar la olla, seleccionar el nivel II y calentar a fuego máximo.
- Cuando el vapor salga de forma continua por la válvula, bajar el fuego hasta el mínimo que mantenga una salida de vapor suave y constante. Empezar a contar el tiempo en ese momento.
- Mantener el tiempo de la tabla vigilando que el vapor no deje de salir. Si se interrumpe, se reinicia el tiempo.
- Apagar el fuego y dejar que la presión baje sola, sin enfriar la olla con agua. Una bajada brusca hace hervir el medio y lo derrama.
- Abrir solo cuando la olla no tenga presión, según el manual.
- Sacar los frascos con guantes térmicos y cerrar las tapas cuando estén templados, no muy calientes, para que el vacío no impida abrirlos después en la glovebox.
- Anotar el ciclo en tu hoja de registro y pasar los frascos a cuarentena (Cómo esterilizar el medio de cultivo en olla a presión y hacer la cuarentena).
Marca el nivel II del selector con un punto de pintura o cinta resistente al calor. Evita que alguien esterilice por error en el nivel I.
Frascos de 25 ml de medio A y dos botellas de 250 ml de agua destilada: manda el recipiente mayor, así que el ciclo es de 40 minutos.
Eliminación del aire
El aire que queda atrapado en la olla baja la temperatura aunque el manómetro marque presión. Por eso no se empieza a contar el tiempo hasta que el vapor sale de forma continua, señal de que el aire ha sido desplazado.
Validación del ciclo
- Cinta indicadora: en cada carga. Solo demuestra que hubo calor, no que se esterilizara.
- Indicador químico integrador (clase 5): en el centro de la carga, al validar la olla y cada vez que cambie la configuración de carga.
- Indicador biológico (esporas de Geobacillus stearothermophilus): al validar la olla y al menos dos veces al año. Se incuba según el fabricante y no debe mostrar crecimiento.
- Mientras la olla no esté validada con indicadores, los tiempos de este PNT se consideran provisionales.
- Qué mide
- Si cada ciclo se hizo con el nivel, el tiempo y el indicador correctos.
- Fórmula
ciclos conformes ÷ ciclos totales × 100- Objetivo
- 100 %
- Si no cumple
- No liberar la carga hasta revisar el ciclo.
Seguridad
- No abrir nunca con presión. No forzar el cierre.
- No obstruir las válvulas; limpiarlas según el manual.
- Guantes térmicos para sacar los frascos.
Paso a paso: Cuarentena y liberación del medio
Objeto
Comprobar que los frascos esterilizados están libres de contaminación antes de sembrar en ellos, y decidir si se liberan, se repiten o se desechan.
Fundamento
Si la esterilización falla, los microorganismos supervivientes crecen en el medio en pocos días: las bacterias suelen hacerse visibles antes que los hongos. Una espera mínima evita sembrar semilla valiosa en un frasco ya contaminado.
Procedimiento
- Colocar los frascos del lote en un lugar limpio, a la temperatura de la sala de cultivo (20–25 °C), protegidos del polvo y de la luz directa.
- Mantenerlos al menos 7 días. Si la sala está más fría, prolongar la cuarentena.
- Revisar a los días 3 y 7 cada frasco, con buena luz y sin abrirlo, según la tabla siguiente.
- Anotar el resultado por frasco en tu hoja de registro.
- Liberar el lote para siembra o repique. Si hay frascos contaminados, retirarlos sin abrir (Seguridad y zona estéril para el cultivo in vitro) y valorar el ciclo de esterilización.
Mira cada frasco a contraluz con una linterna, girándolo despacio. Las colonias pequeñas y la turbidez se ven mucho antes que con luz de techo.
Criterios de revisión
| Observación | Interpretación | Acción |
|---|---|---|
| Medio uniforme, sin manchas, firme | Correcto | Liberar |
| Turbidez, burbujas, capa brillante o viscosa en superficie | Bacterias | Desechar el frasco sin abrir |
| Puntos o manchas algodonosas, de color | Hongos | Desechar el frasco sin abrir |
| Medio blando o líquido | Agar insuficiente o pH bajo | No usar; revisar la fórmula y el pH |
| Medio muy oscurecido o con olor a caramelo | Exceso de calor | Usar con precaución; revisar el tiempo de esterilización |
| Tapa abierta o mal cerrada | Esterilidad no garantizada | No usar |
Criterios del lote
- Sin frascos contaminados: lote liberado.
- Un frasco contaminado aislado: desechar ese frasco, liberar el resto y vigilarlo en las primeras revisiones de la Fase 6.
- Varios frascos contaminados: no liberar el lote. Revisar el ciclo (tiempo, eliminación del aire, carga) y validarlo con indicadores (Cómo esterilizar el medio de cultivo en olla a presión y hacer la cuarentena).
- Qué mide
- La calidad conjunta de la preparación y la esterilización.
- Fórmula
frascos contaminados en cuarentena ÷ frascos del lote × 100- Objetivo
- 0 % por lote; revisar el ciclo de olla si supera el 5 %
- Si no cumple
- Ver el análisis del origen en Incubación y contaminación en frascos in vitro.
Conservación de los frascos liberados
- Usar en las semanas siguientes a la liberación, cerrados, en lugar fresco y sin luz directa.
- Revisar de nuevo cada frasco justo antes de usarlo.
- No congelar ni refrigerar frascos con agar sin necesidad: el frío favorece la condensación y el gel puede romperse.
Lista de verificación
Marca cada punto mientras trabajas, no al final. Cualquier «no» merece una nota con lo que has hecho para corregirlo.
Ciclo de esterilización
Cuarentena
Lo esencial
- La olla esteriliza por vapor a presión: en el nivel II (100 kPa) llega a unos 120 °C; en el nivel I (60 kPa), solo a unos 113 °C.
- Siempre nivel II, y el tiempo se cuenta desde que el vapor sale de forma continua.
- Cuanto más medio tenga el frasco, más tiempo necesita: con 25–50 ml, 35 minutos.
- La olla se deja enfriar sola; nunca se abre con presión.
- La cinta indicadora no prueba la esterilidad: solo que hubo calor.
- Una semana de cuarentena antes de sembrar evita perder semillas en frascos contaminados.
Pon a prueba lo aprendido
En una carga hay frascos de 25 ml de medio A y dos botellas de 250 ml de agua destilada. ¿Cuánto tiempo hay que mantener la olla en el nivel II?
Preguntas frecuentes: cómo esterilizar el medio de cultivo en olla a presión
¿Sirve una olla a presión doméstica para esterilizar?
Sí, si se usa en su nivel alto. Una olla de 100 kPa alcanza unos 120 °C, prácticamente como un autoclave; un nivel de 60 kPa solo llega a unos 113 °C y no basta con los tiempos de referencia.
¿Cuánto tiempo hay que esterilizar los frascos?
Depende del volumen de cada recipiente. A 121 °C, unos 20 minutos para frascos de hasta 25 ml y 25 minutos para 50 ml. En una olla de 100 kPa recomendamos 35 minutos para frascos de 25–50 ml, contados desde que sale vapor de forma continua.
¿La cinta indicadora garantiza que está estéril?
No. Solo demuestra que la carga se expuso al calor. La esterilidad se valida con indicadores biológicos de esporas de Geobacillus stearothermophilus.
¿Por qué hay que dejar el medio en cuarentena?
Porque si la esterilización falla, los microorganismos supervivientes se hacen visibles en pocos días. Esperar al menos 7 días evita sembrar semillas valiosas en frascos ya contaminados.
Referencias
- Monix (Isogona SL). Olla a presión Tempo (ref. M541002): manual de instrucciones de uso y mantenimiento (monix.es).
- Burger, D. W. (1988). Guidelines for autoclaving liquid media used in plant tissue culture. HortScience, 23: 1066–1068.
- George, E. F., Hall, M. A. y De Klerk, G.-J. (eds.) (2008). Plant Propagation by Tissue Culture, 3.ª ed., vol. 1. Springer.
- Rutala, W. A., Weber, D. J. y HICPAC (2008, actualizada). Guideline for Disinfection and Sterilization in Healthcare Facilities. Centers for Disease Control and Prevention (CDC).
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